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乳腺生物反应器表达产物的分离纯化
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乳腺生物反应器技术是利用雌性动物产仔后乳腺分泌乳汁的特点,以乳腺特异表达的乳蛋白基因的调控序列构建外源基因表达载体,制作转基因动物,指导外源基因在动物乳腺中特异高效地表达,继而从转基因动物乳汁中获得外源性重组蛋白的一种转基因技术。20世纪80年代,乳腺生物反应器技术逐渐兴起。国际上相继出现了美国的 GTC(Genzyme Transgenics)、英国的 PPL(PPL-Therapeutics)、荷兰的 PBV(Pharming BV)、日本的Somitomo Metals、加拿大的Nexia等以乳腺生物反应器技术为核心的公司。我国对乳腺生物反应器的研究起步较早,1983年,中国科学院上海细胞生物学研究所施履吉院士首次提出利用转基因动物乳腺生产重组蛋白的构想,并在国内率先获得表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔,为中国乳腺生物反应器研究奠定基础。上海医学遗传研究所、复旦大学遗传所、中国农业大学农业生物技术国家重点实验室、青岛森淼实业有限公司、上海杰隆生物工程股份有限公司等科研单位和企业先后在人凝血因子IX、人乳铁蛋白、人抗凝血酶III等重组蛋白的研发和产业化工作。
自2006年8月全球第一个通过乳腺生物反应器生产的药物 ATryn (重组人抗凝血酶III)批准上市以来,已有越来越多的重组蛋白进入临床研究和上市销售。乳腺生物反应器技术具有表达量高、成本低廉、表达产物活性高等诸多优点,已经成为生物反应器研究中最具有发展前景的领域之一,但其表达产物的分离纯化步骤依然是制约该技术产业化的主要瓶颈之一。
一、分离纯化的难点
乳腺生物反应器分泌的乳液成分非常复杂,给重组目标的分离纯化带来严峻的挑战。分离纯化的难点主要体现在如下3方面:1)乳液成分复杂,含有大量的酪蛋白胶体、脂类颗粒以及乳糖等多种杂质,对介质的污染和蛋白的有效吸附与分离造成极大的负面影响;2)目标蛋白含量低,表达量通常在0.1-5 mg/ml的水平,而牛、羊乳汁中蛋白质、脂肪、乳糖等物质的含量高到13%左右(约130 mg/ml);3)乳液中存在和重组蛋白同源的蛋白质(如乳铁蛋白),以及和重组人源化单克隆抗体结构和性质相似的牛或羊抗体,纯化难度极大。如何克服上述困难,筛选合适的原料预处理方法、设计和优化高效的分离纯化工艺、开发高效的介质清洗方法,是实现乳腺生物反应器表达的重组蛋白高效纯化和实现产业化的关键所在。
二、分离纯化实例剖析
乳腺生物反应器表达的重组蛋白种类繁多,纯化步骤和难点更有所不同。本文选取几种具有代表性的重组蛋白为例,分别介绍其分离纯化方案,为其它重组蛋白的分离纯化方案设计提供借鉴和参考。
1、重组人抗凝血酶III
作为全球第一个上市的乳腺生物反应器表达的重组蛋白产品,重组人抗凝血酶III的分离纯化具有重要的参考意义。早期的人抗凝血酶III主要从人血浆中提取,肝素亲和层析是其中纯化效果最高的核心步骤。乳腺生物反应器表达的重组人抗凝血酶III的分离纯化,同样是基于以肝素亲和层析为核心的多步组合层析。GTC 公司的Edmunds等建立了1条由切向流过滤、肝素亲和层析、超滤脱盐、阴离子交换层析、疏水层析和超滤浓缩6个单元操作(含3步层析)组成的分离纯化工艺,最终以53%的目标蛋白收率实现了高纯度样品的制备,并于2006年成功实现产品的上市。
青岛森淼实业有限公司是我国最早从事乳腺生物反应器技术研发和重组人抗凝血酶III产品开发的企业之一。在成功实现重组蛋白高效表达的基础上,2008年起与中科院过程工程研究所生化工程国家重点实验室合作,共同开展重组人抗凝血酶III高效分离纯化工艺开发、中试放大和产品鉴定等研究工作。针对原有纯化工艺存在的操作步骤多、纯化周期长、产品收率低的不足,建立了1条基于等电点沉淀(快速去除酪蛋白等杂质,实现样品的高效预处理)和肝素亲和层析(纯化目标蛋白)的纯化工艺;在此基础上,利用肠激酶切除β-酪蛋白分泌肽,并采用凝胶过滤层析实现了分泌肽的有效去除,最后进行超滤浓缩。在系统研究pH值、洗脱梯度、上样量、操作流速等因素对分离纯化效果影响的基础上,新工艺大大简化了操作步骤、提高了产品收率(目标蛋白收率90.3%);并进一步采用中科院过程工程研究所国家生化工程技术研究中心研制的肝素亲和层析介质(在中科森辉微球技术(苏州)有限公司实现产业化)进行了50批次的小试实验,以及3批次中试放大实验(10L规模的肝素亲和层析柱),进一步降低了分离纯化成本、推动了产业化进度。
2、重组人CD20抗体的分离纯化
牛乳腺生物反应器可以高效表达重组人单克隆抗体,但牛乳中的蛋白质杂质种类较多,特别是牛自身表达的多克隆抗体,与重组人抗体的结构以及物理、化学性质均非常相似,分离难度很大,对重组抗体的分离纯化提出了严峻的挑战。以重组人CD20抗体为例,Grunfeld等采用混合模式的色谱技术分离混合抗体,取得了一定的分离效果,但这种利用抗体疏水性进行分离的方法通用性有限,无法解决所有混合抗体分离的问题。Pollock等提出了可通过亲和色谱分离纯化乳腺生物反应器表达的重组抗体分子,但并未报道其产品中动物抗体的残留量。
根据重组人抗体与牛抗体恒定区的种属差异会导致它们与Protein A配基之间的亲和力强弱存在一定的差异的原理,中科院过程工程研究所生化工程国家重点实验室苏志国研究团队采用自行开发的Protein A亲和层析介质(目前已在中科森辉微球技术(苏州)有限公司实现产业化),利用亲和层析的方法对对重组人CD20抗体进行了纯化。初期研究发现,采用传统的梯度洗脱模式,并不能实现两种不同来源抗体的有效分离,尽管电泳结果显示抗体纯度达到电泳纯,但ELISA分析结果表明重组人CD20抗体还含有高达17.1%的牛抗体;进一步研究发现,在合适的高上样量条件下,采用置换色谱模式(重组人抗体与牛抗体竞争结合到亲和介质上)可以将牛抗体的残余量降低到0.82%的低水平。
为进一步提高抗体纯化技术的通用性,苏志国研究团队进一步发展了免疫亲和层析方法,以羊抗人(CD20)单抗为亲和配基制备了免疫亲和层析介质,实现了重组人CD20单抗的高效纯化,并将牛抗体的残余量降低到0.2%的极低水平。免疫亲和层析方法具有通用性,同样适用于其它重组抗体的分离纯化。
3、重组人乳清白蛋白和乳铁蛋白的分离纯化
通过核移植和体细胞克隆技术成功地在牛乳中表达了重组人乳清白蛋白( recombinant human а-lactalbumin, rHLA),但重组牛乳中的蛋白杂质种类较多,除了大量的酪蛋白胶束之外,还存在多种牛乳清蛋白,如免疫球蛋白、β-乳球蛋白和牛乳清白蛋白( bovine а-lactalbumin,BLA) 等,其中后者是纯化目标产物rHLA的同源蛋白质,两者的氨基酸序列、结构以及物化性质均非常相似,对重组rHLA的分离纯化提出了严峻的挑战。除了采用常规的三步纯化策略或者试错法(trial-and-error)来开发分离纯化工艺外,根据目标蛋白特性及其与其他杂质的差异进行理性的工艺设计是一条更加有效的途径。
蛋白的表面性质主要包括电荷和疏水性,可采用GRASP II软件计算蛋白的表面电势,以及通过如下公式计算蛋白表面平均疏水性(Average surface hydrophobicity, ASH)。通过比较可以看出,两种蛋白的疏水性差异约为8.9%,表面电势差异为21.3%。分别采用疏水层析和离子交换层析进行实际的分离,结果发现疏水层析的分离效果优于离子交换层析,原因在于蛋白的层析行为不仅与其表面的平均性质相关,蛋白表面上的疏水基团和电荷的分布影响更加重大。
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